Le suivi des échantillons : reportage en photo sur leur préparation et leur conservation dans les Centres de Ressources Biologiques

A des temps prédéfinis par la recherche, des échantillons biologiques (sang, salive, etc.) des participants à une étude clinique sont recueillis dans les centres d’investigations cliniques (CIC).  Anonymisés, ils sont adressés à des centres de ressources biologiques (CRB), où des techniciens vont les préparer avant de les envoyer aux laboratoires de recherche qui réalisent les analyses prévues dans le protocole. Cette étape est essentielle pour optimiser l’utilisation des échantillons, c’est-à-dire maximiser le nombre d’analyses réalisées sans augmenter le volume prélevé. Nous vous emmenons dans le centre de ressources biologiques pour comprendre ce qui s’y passe.

Les échantillons biologiques de chaque participant sont envoyés dans l’heure au CRB rattaché pour qu’ils soient traités puis congelés. Ils sont déposés directement par coursier ou par navette agréés pour le transport des échantillons biologiques en général à température ambiante.

Lorsqu’ils arrivent au CRB, les prélèvements sont enregistrés, et les documents remplis préalablement, comme l’attestation de consentement, sont vérifiés. Les heures de prélèvement, de réception et de début de prise en charge technique sont vérifiées et notées. Ce sont des indicateurs de qualité.

Les échantillons reçus sont anonymes. Ils doivent avoir une étiquette spécifique qui retrace leur origine :  le nom du protocole, le but de la visite du participant,  la date et autres détails pertinents. Les étiquettes individualisées sont appliquées sur tous les tubes de chaque participant.

Pour les essais Covicompares, de la salive est recueillie à chaque visite. Arrivée au CRB, la salive est répartie en plus petits conditionnements appelées aliquots qui sont préparés et conservés congelés. Les analyses ne se font pas sur-place au CRB. Les aliquots sont par la suite partagés et envoyés selon les besoins de chaque laboratoire d’immuno-monitoring pour répondre aux objectifs des protocoles.

Le sang se compose de plasma ou de sérum, de globules blancs (dont des cellules immunitaires) de globules rouges (cellules qui transportent l’oxygène) et de plaquettes. Plasma et sérum sont de composition proche : le plasma est préparé à partir du sang recueilli et non coagulé alors que le sérum est préparé à partir du sang recueilli et coagulé. Sérum et plasma sont dépourvus de cellules et contiennent entre autres des protéines, des hormones, des anticorps.

Dans une première étape, les techniciens vont chercher à séparer et isoler les différents composants du sang.

Dans un premier temps, les tubes de sang sont soumis à une centrifugation. Dans la machine, les tubes tournent à grande vitesse, ce qui permet de séparer les composants du sang en fonction de leur densité. Les globules rouges vont se déposer au fond du tube, tandis que le plasma ou le sérum, selon les tubes de prélèvement utilisés, restent en surface. On obtient en effet du plasma ou du sérum suivant que le tube contient ou non un anticoagulant.

De la même manière que la salive, le plasma et le sérum sont séparés et conservés en petits aliquots qui sont congelés.

Les globules blancs et les plaquettes restent en suspension dans le plasma au-dessus des globules rouges et nécessitent une étape supplémentaire pour être isolés.

La centrifugation du sang avec des tubes spéciaux, qui possèdent une membrane qui laisse passer uniquement les globules rouges, permet d’obtenir 3 phases, en bas les globules , en haut le plasma et au milieu un anneau de cellules mononucléées (lymphocytes et monocytes) correspondant à une partie des globules blancs. Ce mélange de lymphocytes et monocytes est appelé PBMC.

Les techniciens récupèrent toute la partie supérieure et repassent les tubes dans les centrifugeuses. Toutes les cellules mononuclées qui correspondent en majorité à des cellules immunitaires vont alors se déposer au fond du tube. On obtient alors un culot de cellules immunitaires.

Après plusieurs lavages pour retirer les impuretés, les cellules sont remises en suspension puis comptées et la viabilité est également évaluée. En fonction du nombre de cellules obtenues, les techniciens distribuent les cellules en portions de 10 millions et 5 millions de cellules par ml. Le nombre d’aliquots obtenus à la fin du processus va varier d’un patient à l’autre en fonction du nombre de cellules séparées.

Les cellules sont placées dans une solution qui préserve les cellules lors de la congélation. Des boîtes avec de l’isopropanol permettent d’abaisser doucement la température pour que les cellules aient une congélation lente et qu’elles ne soient pas altérées par le choc thermique. La température baisse environ d’un degré par minute. Les boites sont placées dans les congélateurs à -80°C 24h puis les aliquots sont transvasés dans de l’azote.

En moyenne il faut compter 2h entre les prélèvements qui sont faits au CIC et la congélation.

Pour chaque prélèvement reçu, une feuille d’accompagnement du prélèvement permetde recueillir des informations tout au long de la prise en charge technique. Les techniciens informent les horaires auxquels les prélèvements ont été reçus, combien de tubes ont été réceptionnés, l’heure à laquelle ils ont été traités puis congelés, le nombre d’aliquots préparés, le nom de la centrifugeuse, le nom du technicien, etc.

Ces données sont également enregistrées dans le système de gestion de laboratoire qui répertorie tous les prélèvements pris en charge au niveau du CRB, leur traitement, leur congélation (date et heure de congélation, congélateur où ils sont conservés, etc.) mais aussi toutes les sorties, c’est-à-dire les mises à disposition d’aliquot pour analyse, le laboratoire destinataire et la date de mise à disposition.

Les échantillons de salive, de plasma et de sérum, sont conservés à -80°c dans des congélateurs. Tous les échantillons sont rangés par types. Pour chaque congélateur, le rangement est précisé dans le système de gestion de laboratoire et est précisé sur la façade pour que les recherches d’échantillons soient simples.

Les congélateurs sont sous surveillance H24 et sont suivis régulièrement pour anticiper les pannes. Une sonde au point le plus chaud du congélateur relève la température toutes les 15 minutes à 0,05°C près, ce qui permet d’anticiper les changements de température. Un logiciel recueille les données et déclenche une alarme en cas d’anomalie. Les températures ne dépassent jamais les -70°c et ne vont jamais en dessous de -90°c. Au besoin, un congélateur vide d’appoint est disponible pour transférer les ressources en cas de panne.

Les cellules sont conservées à des températures encore plus froides, à -196°c dans de l’azote. De la même façon que pour les congélateurs, la température est suivie H24. En cas de panne, une cuve vide de secours est prête à l’emploi. Les échantillons sont triés par type de ressources, par essai et par centre dans des racks.

En plus de recevoir des échantillons de CIC proches, le CRB de Cochin centralise des collections d’essais de toute la France. Il reçoit régulièrement des échantillons provenant d’autres CRB et les conserve avant qu’ils ne soient redistribués aux laboratoires de recherche. C’est ce qu’on appelle du bio-banking.